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Intitulé du poste : Doctorant en biologie moléculaire et structurale, développement de nouvelles méthodes (H/F)
Ville : Grenoble
Laboratoire/Institut : IBS
Description du poste : English version here

Description du sujet de thèse

La cristallographie par diffraction électronique sérielle (serial-ED) est une méthode émergente de biologie structurale dans laquelle les données sont collectées à partir de nanocristaux de protéines à l'aide d'un faisceau d'électrons de taille submicronique.
Cette méthode est pressentie pour mener l'avenir de la nano-cristallographie, compte tenu de son coût limité et de la quantité réduite d'échantillon requise en comparaison de la cristallographie dans les lasers à électrons à électrons libres.
Combinant l'expertise des équipes française et canadienne, le projet abordera trois questions d'importance fondamentale pour faire avancer davantage la serial-ED.

Plus précisément, nous allons (i) tester si la méthode peut être appliquée pour résoudre des structures de protéines nanocristallines dans l'environnement cellulaire (c'est-à-dire in vivo); (ii) déterminer quelle est la plus petite taille de cristal qui peut être sondée par série-ED; et (iii) offrir une preuve de principe pour la réalisation d'expériences résolues en temps sur des nanocristaux macromoléculaires par serial-ED. Les études de la thèse permettront d'explorer les limites de la serial-ED, repoussant ainsi celles de la nano-cristallographie statique et résolue dans le temps.

Contexte de travail

Description du sujet de thèse :
Au cours des dix dernières années, la biologie structurale a connu au moins trois révolutions. D'abord, l'introduction des lasers à électrons libres émettant dans le domaine des rayons X (XFEL) et l'introduction de la cristallographie sérielle (SX) ont ouvert une porte sur la détermination de structures macromoléculaires à partir de nano-cristaux et la cristallographie résolue en temps ultra-courts – spécifiquement, jusqu'à la centaine de femto-secondes. Ensuite, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) a été transformée par l'introduction de détecteurs ultra-sensibles, qui permettent désormais de résoudre des structures à résolution atomique sans recourir à la cristallisation de l'objet d'intérêt. A mi-chemin entre les deux techniques, la micro diffraction électronique (µED) a été largement augmentée, permettant la résolution de structures atomiques à partir de nanocristaux dans des installations plusieurs ordres de grandeurs plus petites que les XFEL. Dans les trois cas de figures, l'avancée a été permise par la réduction de la dose déposée sur l'échantillon pour la collecte d'une image (cryo-EM) ou d'une cliché de diffraction (SX et µED). Récemment, le groupe de Dwayne Miller à l'Université de Toronto a marié SX et µED dans une nouvelle méthode nommée Serial-ED, ou diffraction électronique sérielle. Par celle-ci, il a résolu une structure à 1.55 Å de résolution à partir de corps d'inclusions nanocristallins formé par le granulovirus. La meilleure résolution précédemment obtenue pour ces objets était de 2 Å, en utilisant la SX au sein d'un XFEL.

Considérant le rapport coût/efficacité de la serial-ED, et la quantité largement réduite d'échantillon requise, l'hypothèse centrale sous-tendant cette proposition de thèse est que l'avenir de la nano-cristallographie sera mené par cette méthode. Nonobstant cette conviction, les limites de la serial-ED restent à établir, et ce en menant une étude systématique. Spécifiquement, il reste à (i) tester si la méthode peut être appliquée pour résoudre des structures de protéines nanocristallines dans l'environnement cellulaire, c'est-à-dire in vivo (objectif 1); (ii) déterminer quelle est la plus petite taille de cristal qui peut être sondée par série-ED (objectif 2); et (iii) offrir une preuve de principe pour la réalisation d'expériences résolues en temps sur des nanocristaux macromoléculaires par serial-ED (objectif 3). Au cours de cette thèse, nous tenterons d'offrir une réponse à ces trois questions d'importance fondamentale pour le futur de la méthode, en combinant l'expertise de l'équipe du Prof. Dwayne Miller de l'Université de Toronto (serial-ED [1], design de microscopes électroniques et de porte-échantillons adaptés à cette méthode [2-7], cristallographie temps-résolue), avec celle de l'équipe de nano-cristallographie sérielle de l'Institut de Biologie Structurale de Grenoble (résolution de structures par SX [8-12], production de cristaux in vivo [8,11,13,14] et cristallographie temps-résolue [15-17]).

Références:
1. Bücker, R. et al. Serial protein crystallography in an electron microscope. Nature Communications 11, 996 (2020).
2. Besztejan, S. et al. Visualization of Cellular Components in a Mammalian Cell with Liquid-Cell Transmission Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis 23, 46–55 (2017).
3. Schulz, E. C. et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods 15, 901–904 (2018).
4. Mehrabi, P. et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods 16, 979–982 (2019).
5. Mehrabi, P. et al. Time-resolved crystallography reveals allosteric communication aligned with molecular breathing. Science 365, 1167–1170 (2019).
6. Schulz, E. C. et al. Protein crystals IR laser ablated from aqueous solution at high speed retain their diffractive properties: applications in high-speed serial crystallography. J Appl Cryst 50, 1773–1781 (2017).
7. de Kock, M. B., Azim, S., Kassier, G. H. & Miller, R. J. D. Determining the radial distribution function of water using electron scattering: A key to solution phase chemistry. J. Chem. Phys. 153, 194504 (2020).
8. Colletier, J.-P. et al. De novo phasing with X-ray laser reveals mosquito larvicide BinAB structure. Nature 539, 43–47 (2016).
9. Colletier, J.-P. et al. Serial Femtosecond Crystallography and Ultrafast Absorption Spectroscopy of the Photoswitchable Fluorescent Protein IrisFP. J Phys Chem Lett 7, 882–887 (2016).
10. Coquelle, N. et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 71, 1184–1196 (2015).
11. Sawaya, M. R. et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. PNAS 111, 12769–12774 (2014).
12. Tetreau, G. et al. De novo determination of mosquitocidal Cry11Aa and Cry11Ba structures by serial femtosecond crystallography on nanocrystals. manuscript in preparation.
13. Tetreau, G. et al. Serial femtosecond crystallography on in vivo-grown crystals drives elucidation of mosquitocidal Cyt1Aa bioactivation cascade. Nat Commun 11, 1153 (2020).
14. Zárate-Potes, A. et al. The C. elegans GATA transcription factor elt-2 mediates distinct transcriptional responses and opposite infection outcomes towards different Bacillus thuringiensis strains. PLoS Pathog 16, e1008826 (2020).
15. Coquelle, N. et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nat Chem 10, 31–37 (2018).
16. Woodhouse, J. et al. Photoswitching mechanism of a fluorescent protein revealed by time-resolved crystallography and transient absorption spectroscopy. Nat Commun 11, 741 (2020).
17. Nass Kovacs, G. et al. Three-dimensional view of ultrafast dynamics in photoexcited bacteriorhodopsin. Nat Commun 10, 3177 (2019).

Contexte de travail :
Cette thèse est financée par le programme des Thèses internationales du CNRS. Les études seront réalisées au sein de l'équipe de Nano-Cristallographie Sérielle (groupe DYNAMOP) de l'Institut de Biologie Structurale de Grenoble, France, sous la supervision du Dr. Jacques-Philippe Colletier. La thèse s'inscrit dans le contexte d'une collaboration avec le groupe du Prof. Dwayne Miller à l'Université de Toronto. La rémunération approximative est fixée à 2 135 € brut mensuel, pour une prise de fonction le 1er octobre 2021.

Informations complémentaires / profil souhaité :
Le profil de candidat souhaité sera celui d'une ou d'un biologiste moléculaire ou biochimiste informé.e sur les différentes méthodes de la biologie structurale, et que nous formerons à la production et la purification de cristaux au sein de la bactérie Bacillus thuringiensis. Une formation dans ce dernier domaine serait un réel avantage. Cet.te étudiant.e devra cependant être intéressé.e par la résolution de structures tridimensionnelles à partir de tels cristaux, et par l'apprentissage de nouvelles techniques en biophysique et en biologie structurale.
Le sujet de thèse proposé englobe en effet un vaste champs de compétences allant de la production de nanocristaux in vivo, au traitement de données de cristallographie électronique sérielle, à l'extrapolation de facteurs de structures et à la détermination structurale. La/le doctorant.e IBS/UGA sera en charge de la production in vivo des échantillons nanocristallins, incluant les nanocristaux de toxines naturellement cristallines Cyt1Aa, Cry11Aa et Cry1Ae, mais aussi ceux, recombinants, de protéines non-naturellement cristallines exprimées sous contrôle d'un vecteur activé par le déclenchement de la sporulation et transformé dans une souche acristallifère (i.e. dépourvue de son mégaplasmide naturel) de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Ces cristaux seront étudiés par diffraction électronique sérielle (serial-ED) après extraction et purification, mais aussi au sein même des cellules – et, en ce qui concerne les cristaux de Cyt1Aa, Cry11Aa et Cry1Ae, à différentes étapes de leur croissance. Ainsi, une caractérisation fine de la croissance sera réalisée par microscopie optique et atomique (à l'IBS) – puis répétée par microscopie électronique et serial-ED (à l'Université de Toronto). La/le doctorant.e étudiera l'effet de paramètres tels que la température et le pH sur la nucléation et la croissance cristalline, notamment celle de nanocristaux recombinants de protéines non-naturellement cristallines (protéines 'cargo'). Dans ce contexte, elle/il devra produire plusieurs vecteurs exprimant soit les protéines cargo d'intérêt, soit leurs fusions avec des protéines naturellement cristallines adjointes à leurs extrémités N-, C- ou N- et C-terminales. La/le doctorant.e sera formé au traitement de données en cristallographie sérielle et à la résolution de structure cristallographiques à l'IBS. Elle/il sera familiarisé à la collecte de données en serial-ED au cours de visites dans le groupe du Prof. Miller, à l'université de Toronto. Idéalement, une visite par an sera organisée sur fonds.

Date limite de candidature le 18 juin 2021
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Durée du contrat : 3 ans
Date de prise de fonction : 1er octobre 2021
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